第四节　免疫球蛋白、循环免疫复合物与补体检测技术

一、免疫球蛋白检测技术

（一）IgG、IgM和IgA检测

1.检测方法

对人体的血液、尿液、脑脊液等样本中IgG、IgM、IgA进行定量检测，常用速率散射免疫比浊法，原理参见本章第二节。

2.临床意义

（1）血液标本检测的临床意义

①年龄与性别：不同年龄下，机体血液中免疫球蛋白含量有一定变化，新生儿接近成人水平，婴幼儿低于成人水平，女性稍高于男性。

②血清Ig增高：多克隆性增高常见于肝脏疾病（慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、隐匿性肝硬化等）、结缔组织病、各种急慢性感染、某些自身免疫病等。单克隆性增高见于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤、重链病、轻链病等单克隆Ig增殖病。

③血清Ig降低：低免疫球蛋白血症包括原发性降低、继发性降低两种类型。原发性降低见于体液免疫缺陷病和联合免疫缺陷病。继发性降低见于大量蛋白丢失的疾病（烧伤、剥脱性皮炎、胃病综合征等）、淋巴系统肿瘤（白血病、淋巴肉瘤、霍奇金病等）、重症传染病、血液性疾病、肾脏疾病、中毒性骨髓疾病、长期使用免疫抑制剂等。其中，以肾脏疾病、慢性淋巴细胞性白血病、感染性疾病最多见。

（2）尿液标本检测的临床意义　正常人尿液中的免疫球蛋白含量极微，当机体免疫功能出现异常或由炎症反应引起肾脏疾病时，可导致尿液中含量增多。

（3）脑脊液标本检测的临床意义　神经系统疾病可导致脑脊液中免疫球蛋白含量升高，例如：化脓性脑膜炎、单纯疱疹性脑炎、结核性脑膜炎、急性神经疏螺旋体病、条件致病性脑膜炎、急性病毒感染、多发性硬化、神经梅毒、带状疱疹性神经节炎、脑萎缩等。

（二）IgD检测

1.检测方法

正常人血液中IgD含量极低，一般采用ELISA双抗体夹心法进行检测：先将抗人IgD抗体包被于聚苯乙烯反应板微孔内，加入待测血清或标准品后，再加入酶标记抗人IgD抗体，在固相微孔上形成抗体-待测抗原（IgD）-酶标记抗体复合物，洗涤除去未结合物，最后加入酶底物溶液进行呈色反应，根据呈色强度定量检测血清中IgD水平。

2.临床意义

IgD含量升高主要见于IgD型多发性骨髓瘤、高IgD血症以及周期性发热、慢性感染、大量吸烟者、妊娠末期、某些超敏反应等。IgD降低常见于先天性无丙种球蛋白血症、硅沉着病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。

（三）IgE检测

IgE是血清中含量最低的免疫球蛋白，包括血清中总IgE检测及特异性IgE检测，前者作为初筛试验，后者可用于确定特异性过敏原。

1.总IgE检测

（1）检测方法　常用ELISA双抗体夹心法、免疫比浊法。

（2）临床意义　总IgE升高常见于Ⅰ型超敏反应性疾病（过敏性哮喘、过敏性肠炎、花粉症、变应性皮炎和荨麻疹等），也可见于寄生虫感染、IgE型骨髓瘤、高IgE血症、系统性红斑狼疮、胶原病等非超敏反应性疾病。总IgE降低见于艾滋病、原发性无丙种球蛋白血症、免疫抑制剂治疗后。

2.特异性IgE检测

（1）检测方法

①放射性过敏原吸附试验法：将纯化的过敏原吸附于固相载体上，加入待测血清，若血清中含有针对该过敏原的特异性IgE，则可与之形成抗原-抗体复合物；再与放射性核素（如¹²⁵I）标记的抗人IgE抗体反应，形成“过敏原-固相载体-特异性IgE-放射性核素标记的抗人IgE抗体”复合物，最后以γ计数仪检测放射活性，放射活性与特异性IgE含量呈正相关。

②免疫印迹法：将多种纯化的过敏原吸附于纤维素膜条上，加入待测血清，若血清中含有针对过敏原的特异性IgE，则可与之形成免疫复合物；用酶标记抗人IgE抗体作为示踪二抗，最后加入酶底物溶液使区带呈色，参比标准膜条即可判断过敏原种类，还可通过过敏原检测仪读取检测结果。

③ELISA：先将纯化的过敏原包被于聚苯乙烯反应板微孔内，加入待测血清，若血清中含有针对该过敏原的特异性IgE，即可形成抗原抗体复合物；再与酶标记的抗人IgE抗体反应，最后加入酶底物溶液进行呈色反应，根据呈色强度定性或定量检测血清中特异性IgE水平。

④酶联荧光免疫分析：其固相载体为一内置有多孔性、弹性以及亲水性纤维素微粒的帽状塑料。将多种纯化的过敏原吸附于纤维素微粒上，加入待测血清或参考标准品，若血清中含有针对过敏原的特异性IgE，即可形成抗原抗体复合物；冲洗除去未结合物，再与β-半乳糖苷酶标记的抗人IgE抗体反应，形成“过敏原-固相载体-特异性IgE-β-半乳糖苷酶标记的抗人IgE抗体”复合物，加入4-甲基伞酮-β-半乳糖苷荧光底物，使之产生荧光，最后用荧光分光光度计测量荧光强度，荧光强度与特异性IgE含量呈正相关。

（2）临床意义　血清特异性IgE检测有助于寻找特定过敏原，进行脱敏疗法的疗效监测。

（四）游离轻链检测

Ig轻链根据其恒定区差异分为κ和λ两个型别。正常人血清κ与λ的比例约为2∶1。

1.检测方法

临床常用速率散射免疫比浊法检测游离轻链。

2.临床意义

（1）κ和λ值均增高　见于多克隆免疫球蛋白血症，例如：自身免疫性疾病、肾脏疾病、慢性感染等。

（2）κ或λ值增高　见于单克隆免疫球蛋白血症，例如：多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、轻链病、浆细胞瘤等。

（3）κ或（和）λ值降低　见于低免疫球蛋白血症。

（4）对单克隆免疫球蛋白增殖病的敏感性为88%～98%；对非分泌型骨髓瘤的敏感性为65%～70%。有助于单克隆轻链病、原发性系统性淀粉样变性的早期诊断，也可用于化疗或自身外周血干细胞移植后是否复发的监测。

（五）冷球蛋白检测

冷球蛋白即冷免疫球蛋白，是血清中一种在37℃以下（一般0～4℃）易发生沉淀、37℃时可再溶解的病理性免疫球蛋白，在血清和血浆中均能发生沉淀，可分为1、2、3三型。

1.检测方法

可采用穿刺组织进行电镜病理观察，亦可根据冷球蛋白37℃溶解、4℃时发生可逆性沉淀的物理性质进行血清标本中冷球蛋白的分离提取，再采用紫外分光光度仪检测A₂₈₀，计算蛋白含量；还可采用免疫印迹、双向电泳法准确分析低浓度冷球蛋白。蛋白含量>0.05g/L血清时，即可诊断为冷球蛋白血症。

2.临床意义

冷球蛋白可直接堵塞血管并通过形成的免疫复合物激活补体系统，导致炎症反应及肾损害，常引起全身性血管炎，最常见小动脉炎或静脉炎。1型冷球蛋白血症多见于恶性B细胞疾病，例如：Waldenström巨球蛋白血症、浆细胞瘤等；2型与3型冷球蛋白血症常见于慢性丙型病毒性肝炎。

（六）M蛋白检测

M蛋白即单克隆免疫球蛋白，是单克隆B淋巴细胞或浆细胞异常增殖而产生的大量均一、具有相同氨基酸序列以及空间构象和电泳特性的Ig。

1.检测方法

（1）多发性骨髓瘤与巨球蛋白血症患者M蛋白的检测与鉴定

①血清总蛋白定量：约90%患者血清总蛋白含量升高（70%患者>100g/L），约10%患者含量正常或偏低（如轻链病时）。

②血清蛋白区带电泳：血清（或尿液）标本中不同性质的蛋白质在一定条件下电泳，形成不同的蛋白区带，与正常电泳图谱进行比较分析，很容易发现异常的蛋白区带。将这些区带电泳图谱扫描，可计算出异常蛋白总量和百分比。依据单克隆Ig种类不同，M蛋白可以在α₂～γ区形成深染区带，以β、γ区多见。

③血清Ig定量：为初筛试验，一般M蛋白所属Ig均明显升高，其他Ig则正常或显著降低。

④血清游离轻链定量：κ型或λ型游离轻链含量升高，κ与γ的比值异常。

⑤免疫电泳：是一种定性方法，可确定M蛋白的类别（IgG、IgA、IgM）和型别（轻链）。M蛋白可与相应的抗重链血清、抗轻链血清形成迁移范围十分局限的致密沉淀弧，据此排除或鉴别M蛋白血症。

⑥免疫固定电泳：灵敏度高，是临床最常用的方法。血清或尿液先进行区带电泳，形成不同的蛋白区带，再加入特异性抗重链或抗轻链血清，抗血清即可与相应的蛋白区带形成抗原抗体复合物；洗去未结合蛋白，最后经染料（氨基黑、丽春红）染色，并对比正常人抗血清参考泳道，即可对M蛋白进行鉴定。

⑦尿游离轻链检测：免疫球蛋白过剩的轻链自尿液排出，即本周蛋白，分为定性和定量两种方法。定量检测一般采用免疫比浊法进行。定性试验时，初筛可用热沉淀反应法或对甲苯磺酸法，确诊可用免疫电泳分析法。免疫电泳定性试验可采用轻链-清蛋白-戊二醛免疫电泳法，在戊二醛存在时，尿游离轻链能与牛血清蛋白结合，与抗轻链血清进行对流免疫电泳，轻链与抗κ、λ血清反应产生白色沉淀线；也可采用免疫固定电泳进行检测和分型。

（2）重链病时的M蛋白检测与鉴定　与多发性骨髓瘤相同，但尚需采用选择性免疫电泳予以证实。将抗Fab或多价抗轻链血清与融化琼脂混匀制成琼脂板，常规打孔、加样、电泳。抗体槽中可加相应的抗Ig血清（例如：检测γ重链病加抗IgG血清，检测α重链病加抗IgA血清等）。电泳时，血清中正常Ig被琼脂中抗Fab或抗轻链血清选择性阻留，重链则继续向阳极移动，形成单一沉淀弧。

（3）7S IgM病的M蛋白检测与鉴定　除上述方法外，还需证实7S IgM的存在。IgM通常为五聚体，沉降系数为19S，而7S IgM病患者IgM为单体，沉降系数为7S。证实7S IgM的存在有两种方法：①在测定总IgM含量后，将1～2mL待测血清过Sepharose 6B柱，再根据洗脱峰面积计算7S IgM占总IgM的百分比，IgM总量乘以百分比即得7S IgM含量。②采用植物血凝素（PHA）选择性电泳，五聚体IgM可与PHA结合，而单体IgM不与PHA结合。制备含PHA的琼脂，常规制板、打孔、加样、电泳。五聚体IgM被琼脂中PHA选择性阻留，7S IgM则继续向阳极移动，并可与随后加于抗体槽中的抗IgM血清反应，形成单一沉淀弧。

（4）半分子病的M蛋白检测与鉴定　半分子是指由一条重链和一条轻链组成的M蛋白。检测与鉴定方法与多发性骨髓瘤相同，但尚需对“半分子”进行鉴定。

①免疫电泳法鉴定半分子M蛋白的迁移率。与Ig相比，半分子M蛋白泳向正极，可达α₂区。

②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）推算M蛋白的分子量。

③超速离心法测定M蛋白的沉淀系数。

④Fc抗原决定簇的确定：用正常人抗重链血清判断半分子病患者M蛋白相应的Ig类别。

2.临床意义

M蛋白可分为恶性M蛋白血症、意义不明的M蛋白血症两类。恶性M蛋白血症多见于多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、7S IgM病、半分子病、慢性淋巴细胞白血病、不完全骨髓瘤蛋白病等。意义不明的M蛋白血症又可分为两种，一种继发于其他恶性肿瘤（如恶性淋巴瘤），另一种为良性M蛋白血症，较多见于老年人。

二、循环免疫复合物检测技术

抗原与其相应抗体形成免疫复合物（immunocomplex， IC），循环在血液里的免疫复合物即循环免疫复合物（circulating immunocomplex，CIC）。

（一）检测方法

1.聚乙二醇（PEG）沉淀比浊法

PEG能非特异性沉淀蛋白质，低浓度的PEG可使大分子量CIC自液相析出。PEG还可抑制CIC解离，促进CIC进一步聚合成更大的凝聚物而被沉淀。利用免疫比浊法即可确定CIC的存在与含量。

2.ELISA法

补体第一成分C1q能与IgG或IgM类抗体的Fc段结合，因此可根据C1q来检测CIC含量。以IgG为例：先将C1q包被于聚苯乙烯反应板微孔，加入待测血清使CIC与C1q结合，洗涤后再加入酶标记的抗人IgG抗体，在固相上形成C1q-CIC-酶标记抗人IgG复合物；洗涤除去未结合物，最后加入酶底物溶液进行呈色反应，呈色强度反映待测血清中CIC含量。

（二）临床意义

CIC升高最常见于感染性疾病和自身免疫性疾病。CIC检测主要用于诊断与循环免疫复合物相关的疾病、监测疗效和评估病情。低浓度CIC可散见于正常人，亦可在无明显疾病时一过性出现。持续增高的免疫复合物提示有慢性原发性疾病存在，包括各种风湿病、肿瘤和慢性感染等。

三、补体检测技术

（一）补体经典途径溶血活性（CH₅₀）检测

1.检测方法

补体最主要的生物学活性是免疫溶细胞作用。抗体（溶血素）致敏的绵羊红细胞（SRBC）可通过活化补体（C1～C9）激活经典途径，导致SRBC溶解。在一定范围（20%～80%溶血率）内，溶血程度与补体活性呈正相关，常以50%溶血率（50% complement hemolysis，CH₅₀）作为判断指标。

2.临床意义

CH₅₀ 活性增高见于急性炎症、肿瘤（骨髓瘤、肝癌等）、组织损伤与感染、自身免疫性疾病（类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等）等。

CH₅₀ 活性降低见于先天性补体缺陷症、各种肝病患者（肝炎、肝硬化、肝癌等）、免疫功能不全、急性肾小球肾炎、全身性红斑狼疮活动期、大面积烧伤、肾病综合征等。

（二）补体旁路途径溶血活性（AH₅₀）检测

1.检测方法

先用乙二醇双（α-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）螯合血清中的Ca²⁺，封闭C1作用，以阻断经典活化途径。再用可使B因子活化的未致敏兔红细胞（RE）激活补体旁路途径，导致RE溶血，其溶血率与补体旁路途径的活性呈正相关，以50%溶血素为判别指标，即AH₅₀。

2.临床意义

补体C3、C5～C9、P因子、D因子、B因子等成分参与补体旁路活化，任何成分的异常均可引起旁路溶血活性的改变。AH₅₀ 增高多见于甲状旁腺功能亢进、感染、某些自身免疫病、肾病综合征、慢性肾炎、肿瘤等。降低则见于慢性活动性肝炎、肝硬化、急性肾炎等。

（三）补体C3、C4含量检测

1.检测方法

一般采用速率散射比浊法。

2.临床意义

C3、C4属急性时相反应蛋白，含量增高见于急性炎症、全身性感染、风湿热急性期、皮肌炎、心肌梗死、Reiter综合征、严重创伤、恶性肿瘤、妊娠等，对疾病的诊断意义不大。

C3、C4含量降低见于肝炎、肝硬化、活动期系统性红斑狼疮、各类免疫复合物病（类风湿关节炎、冷球蛋白血症、血清病等）、大面积烧伤以及遗传性C3、C4缺乏症等。

在自身免疫性溶血性贫血、遗传性神经血管瘤时，C3一般正常，而C4常下降。在系统性红斑狼疮时，C4的降低常早于C3。

（四）补体C1q含量检测

1.检测方法

多采用速率散射比浊法。

2.临床意义

C1q是补体C1的重要组成成分，主要参与补体的经典激活途径。其增高见于血管炎、骨髓炎、类风湿关节炎、痛风、硬皮病等；降低见于系统性红斑狼疮、活动性混合性结缔组织病等。