- 全国临床检验操作规程(第4版)
- 尚红 王毓三 申子瑜主编
- 5249字
- 2021-04-16 17:04:50
第二节 血清氯化物测定
氯( chlorine,Cl)是细胞外液中主要的阴离子。正常成人每日平均摄入70~210mmol ( 2.5~7.4g)的氯。人体摄入的氯约70%存在于血浆、细胞间液和淋巴液中,仅少量存在于细胞内液和分泌Cl -的细胞内,另有一部分存在于结缔组织和胶原纤维等处。氯的主要生理功能基本与钠相同,在维持体内的电解质平衡、酸碱平衡和渗透压平衡中起相同的作用。体内氯主要经肾随尿液排出体外。
氯离子的测定方法有:放射性核素稀释法、电量滴定法、分光光度法、离子选择电极法( ISE)、硝酸汞滴定法和酶法。放射性核素稀释质谱法是氯测定的决定性方法,临床常用的检测方法为ISE法。
1.离子选择电极法( ISE)
是目前测定氯最好的方法。离子选择电极法广泛应用于全自动生化分析仪。按其测定过程分为直接测定法及间接测定法。由于间接测定法将待测样本稀释后测定、所测离子活度更接近离子浓度,是目前测定氯最常用的方法,具有简便、快捷、准确等优点。ISE法精密度和准确度均较酶法为优。且不受高脂血清干扰,管状液膜电极性能稳定,成本低,便于自动化,且可进行多项目组合分析,目前应用最普遍。2001年CAP能力比对试验调查中99%医院使用ISE方法。
2.电量滴定法
精密度高,又不受光学干扰,所以既是AACC选定的血清氯测定方法,又是NBS的参考方法,电量滴定法和ISE法在方法学上具有相近的实验室间变异系数。1996年,美国CAP的质控调查中,发现只有1%的实验室在使用库仑-安培计滴定法。目前,国内也很少有实验室采用此方法测定氯化物。
3.分光光度法
分两类,一类是硫氰酸汞比色法,另一类是酶法。硫氰酸汞比色法的变异系数稍高。酶法的优点是便于自动化,不需特殊仪器,缺点是价格较贵。
4.硝酸汞滴定法
判断滴定终点比较困难,且受胆红素、血红蛋白和血脂的干扰,因此本法精密度明显不佳,且工作效率低,故不建议采用。
一、检测方法
(一)离子选择电极法 【原理】
离子选择电极含有氯化银晶体,通过膜与样本隔离,样本中的氯离子通过膜移动嵌入晶体的栅状结构。在此过程中,将会产生一个电位差并与具有恒定电压的参比电极作比较测量,这两者的电位差值即与样本中的氯离子浓度成比例。
【仪器】
一般都是由K +、Na +、Cl -三种电极组合的电解质分析仪。
【试剂】
氯测定所需的试剂和标准液是与钾、钠电极应用的缓冲液和标准液组合在一起,不单独配制。
1. ISE稀释液
主要成分为Bis-Tris、硼酸、甲醛溶液。
2. ISE参比电极液
主要成分为氯化钾。
3. ISE内部标准液
主要成分为Bis-Tris、硼酸、氯化钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠。
各厂家仪器都有配套试剂供应,但配方未完全公开。详见各厂家试剂说明书。
【操作】
操作方法和步骤与用钾、钠电极测定K +、Na +相似。必须严格按照自动分析仪的说明书操作。
仪器型号很多,所用电极基本相同。各种型号ISE分析仪的试剂配方、试剂用量、操作方法有所不同,在保证方法可靠的前提下,应按仪器和试剂说明书设定测定条件,进行定标品、质控样品和血清样品分析。
主要参数
方 法:离子选择电极法 样本/试剂: 1/31
主波长:无 反应温度: 37℃
副波长:无 反应时间:无
一般要进行下列步骤:
1.开启仪器,清洗管道。
2.仪器校准 用适合本仪器的低、高值校准溶液,确定氯电极的斜率值,然后用已知浓度的血样定标品做校准验证,算出标准曲线的补偿值,仪器自动加上补偿值(注:每日校准后,标准曲线的斜率和补偿值必须在仪器允许的范围内)。
3.校准通过后,应至少做2个浓度水平的质控品,质控通过后,做临床标本。
4.间接法的样品由仪器自动稀释后再行测定。直接法的样品可直接吸入电极管道进行测定。
5.测定结果由仪器内微处理器计算后打印数值。
6.每天用完后,清洗电极和管道后再关机。若用于急诊检验室,可不关机,自动定时清洗和单点校准,随时使用。
【结果计算】
C Cl=C IS×10 ( E Cl-E IS) /SL C Cl’=C Cl+补偿值
式中:
C Cl:补偿前Cl -浓度;
E Cl: Cl -的电动势;
C Cl’: Cl -浓度;
E IS: ISE内部标准液的电动势;
C IS: ISE内部标准液浓度;
SL:斜率值( SLOPE值)
全自动生化分析仪系统内部进行所有数据计算,并产生最终报告结果。
【注意事项】 1.仪器维护保养
按照仪器说明书进行操作和维护保养,电极老化需及时更换。
2.标本放置时间与保存温度
测定血标本时,室温放置30~45分钟后离心分离血浆或血清。室温下,从接收标本到上机检测的最长时间限制是4小时,15℃到30℃的环境下不应超过8小时。如无法在4小时内完成,血清或血浆应该被保存在2~8℃,在48小时内完成测定。
3.尿液标本要求
采集尿样时,整个收集的过程应该在2小时内完成。若是检测24小时尿液的样本,保存样本的容器应该放置在冰箱或是在保存的过程中持续冰浴。假如需要防腐剂,应当在尿液收集前事先加入容器中。
(二)电量分析法
电量分析法常用的氯化物测定仪是一种用电量滴定法测定氯化物的专用仪器,国内已有数家仪器厂生产。此法操作简便,也适合于常规检验用。
【原理】
体液中氯化物的电量滴定法是仪器在恒定的电流和在不断搅拌的条件下,以银丝为阳极,不断生成的银离子与氯离子结合,生成不溶性的氯化银沉淀。当标本中氯离子与银离子作用完全时,溶液中出现游离的银离子,此时溶液电导明显增加,使仪器的传感装置和计时器立即切断电流并自动记录滴定所需的时间。溶液中氯化物浓度用法拉第常数进行计算( 96487库仑/摩尔氯化物)。库仑与滴定时间和电流的乘积成正比。但在实际应用时不测电流,只须准确测定滴定标本所需的时间与滴定标准液所需时间进行比较,最后由微处理器自动换算成浓度,数字显示测定结果。
【试剂】 1.酸性稀释液
取冰醋酸100ml、浓硝酸6.4ml加于盛有约800ml蒸馏水的1L容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,此溶液较稳定。
2.明胶溶液
将明胶6g,水溶性麝香草酚蓝0.1g及麝香草酚0.1g溶解于1000ml热蒸馏水中,冷却,并分装于试管中,每管约10ml,塞紧并置冰箱保存,明胶溶液在室温中不稳定,室温过夜后即不能使用。
3.氯化物标准液
100mmol/L。
【操作】 1.血清(浆)或脑脊液标本
( 1)于滴定杯内加入去离子水0.1ml,酸性稀释液4ml,明胶溶液4滴,调节仪器使读数为零。
( 2)每天测定前应先用氯化钠标准液校准仪器。校准时,加氯化钠标准液0.1ml,酸性稀释液4ml,明胶液4滴,调节标准读数,使显示值为100mmol/L。
( 3)同法滴定血清标本,即以0.1ml血清代替标准液,读出测定结果,此为血清氯化物的浓度。
2.尿液
尿液中氯化物含量的波动范围比血液大,为使所取的标本量适应仪器的测定范围,需要取不同量的标本进行测试。标本用量不得少于血清的1/3,亦不宜超过血清量的1倍,即0.03~0.2ml。尿液测定方法同血清的测定方法。
【注意事项】 1.仪器维护保养
每次滴定后,银电极用蒸馏水清洗数次后擦干。不同厂家仪器的操作方法和维护保养略有差别,请严格按照说明书进行。
2.线性范围
可达150mmol/L。
(三)硫氰酸汞比色法 【原理】
标本中的氯离子与硫氰酸汞反应,生成极难解离的氯化汞,并释放出相应当量的硫氰酸离子。后者与试剂中铁离子结合生成色泽很深的橙红色硫氰酸铁,吸收峰在460nm,色泽强度与氯化物的含量成正比。
Hg ( SCN)2+2Cl→HgCl2+2SCN-
3SCN-+ Fe3 +→Fe ( SCN)3(橙红色)
1.手工检测 【试剂】 ( 1)饱和硫氰酸汞溶液:
称取硫氰酸汞2.0g,溶于1L蒸馏水中,放室温48小时,并经常摇动,取上清液应用。
( 2)硝酸汞溶液:
称取硝酸汞6.0g,用50ml蒸馏水溶解,加入1ml浓硝酸并稀释至100ml。
( 3)显色应用液:
称取硝酸铁[Fe ( NO 3) 3· 9H 2O]13g,加水约400ml溶解,再加入1.5ml浓硝酸、500ml饱和硫氰酸汞溶液和5ml硝酸汞溶液,最后用水稀释至1000ml,用塑料瓶存放,置室温保存。
( 4)氯化物标准液:
100mmol/L。
( 5)空白试剂:
称取硝酸铁13g,溶于400ml蒸馏水中,加浓硝酸1.5ml,再稀释至1000ml。
【操作】
取试管4支标明测定管、测定空白管、标准管和试剂空白管,然后按表2-3-2操作。
表2-3-2 氯化物比色法测定操作步骤
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表中各管混匀,置室温10分钟,分光光度计波长460nm,比色杯光径1cm,以试剂空白管调零,读取各管吸光度。
【结果计算】
2.自动化仪器操作 【试剂】
同“1.手工检测”。
【操作】
血清样品与试剂混合、温育,一定时间后监测特定波长下的吸光度。主要反应参数如下:
方 法:硫氰酸汞比色法/终点法
样本/试剂: 3μl/300μl
主波长: 460~500nm 反应温度: 37℃
副波长: 700nm 反应时间: 10分钟
不同实验室具体反应条件会因所使用的仪器和试剂而异,在保证方法可靠的前提下,应按仪器和试剂说明书设定测定条件,进行定标品、质控样品和血清样品分析。
【结果计算】
测定管吸光度为A 1,空白管吸光度为A 2。ΔA = A 1-A 2。
全自动生化分析仪系统内部进行所有数据计算,并产生最终报告结果。
3.注意事项 ( 1)干扰因素:
本法对氯离子并非绝对特异,其他一些卤族元素如F -、Br -、I -亦能取代硫氰酸离子,与汞离子结合生成卤素汞,同时游离出硫氰酸离子,产生同样的呈色反应。但在正常人血液中,上述元素含量很低,这种干扰可以忽略不计。若接受大量含上述卤素离子药物治疗时,可使血清中氯测定结果偏高。高脂样本会产生浑浊而干扰测定,某些药物及胆红素对测定也有一定影响。
( 2)超限标本处理:
本法线性范围较窄( 80~125mmol/L)。若标本中氯化物含量>125mmol/L或低于80mmol/L时,应将标本用蒸馏水进行1∶1稀释或将标本用量加大0.5倍后再进行检测,其结果乘以稀释倍数或除以标本加大的倍数。
( 3)应用液要求:
显色应用液的呈色强度与硫氰酸汞和硝酸汞的含量有关。如呈色过强,线性范围在125mmol/L以下,要增加硝酸汞的用量。呈色太弱,要增加硫氰酸汞的用量。因此,在测定前要调整好显色应用液的灵敏度,在波长460nm,比色杯光径10mm,标准管吸光度值应在0.4左右为宜。
( 4)室温要求:
本法对温度非常敏感,吸光度随温度升高而增加;呈色温度应不低于20℃。室温过低,易产生混浊,影响比色。
( 5)方法学特点:
本法适用于自动生化分析仪,反应条件易控制,所测结果比较理想。若用手工法测定,每批应采用三点标准( 70mmol/L、100mmol/L、120mmol/L),可克服标准曲线不通过零点及不同温度呈色不一致而带来测定结果的误差。
( 6)质控血清要求:
每批标本测定,应同时测定正常和异常值的质控血清,所得值应该在允许误差范围内,否则应寻找误差原因。
(四)酶法测定 【原理】
α-淀粉酶催化2-氯-4-硝基苯-α-D-麦芽三糖苷解离生成2-氯-4-硝基酚( CNP)和麦芽三糖( G3),CNP的最大吸收峰在405nm,连续监测405nm吸光度变化可直接反映CNP生成量,其与酶活力成正比。氯离子是α-淀粉酶的激动剂,反应速率变化可反映氯化物的浓度,反应式如下:
【试剂】 1. R1试剂
PIPE Buffer pH 6.0
4-吗啡啉乙酰硫磺酸 100mmol/L
α-淀粉酶 2000U/L
EDTA-Ca 2mmol/L
2. R2试剂
2-氯-4-硝基苯-麦芽三糖苷( CNP-G3)
5mmol/L
Maltose 100mmol/L
【操作】
氯的酶法必须严格按照试剂盒说明书操作。下列主要参数与方法供参考:
血清样品与试剂R1混合,温育,加入试剂R2,迟滞一定时间后监测特定波长下的吸光度。主要反应条件如下:
反应类型 两点速率法
反应方向 反应吸光度上升
样本/试剂 7μl/150μl/150μl
吸光度监测时间 3.5分钟
反应温度 37.0℃
波长 405nm/660nm
温育时间 5分钟
迟滞时间 1.5分钟
不同实验室具体反应条件会因所使用的仪器和试剂而异,在保证方法可靠的前提下,应按仪器和试剂说明书设定测定条件,进行定标品、质控样品和血清样品分析。
【结果计算】
测定管吸光度为A 1,空白管吸光度为A 2。ΔA = A 1-A 2。
全自动生化分析仪系统内部进行所有数据计算,并产生最终报告结果。
【注意事项】
基于钙离子和氯离子是α-淀粉酶的激动剂原理,使用α-淀粉酶和CNP-G3进行血清氯化物的直接酶法测定。实验发现反应液中钙离子和氯离子浓度对测定结果有显著影响,将样品与试剂的比例调整到1∶150测定结果最好。同时,由于样品测定时被稀释150倍,大大提高了本方法的抗干扰性能。
突出优点表现在抗干扰方面,不受卤族元素溴、碘及硫氰酸等阴离子的干扰,能反映血清氯化物水平的真实性,具有显著的实用性。
二、参考区间
成人:
血清或血浆氯化物: 96~108mmol/L。
尿液氯化物: 170~250mmol/24h。
脑脊液氯化物: 120~132mmol/L。
以上参考区间引自WS/T 404.2—2012《临床常用生化检验项目参考区间》和《全国临床检验操作规程》(第3版)。
三、临床意义
1.血清氯化物异常 ( 1)血清(浆)氯化物增高:
临床上高氯血症常见于高钠血症、失水大于失盐、氯化物相对浓度增高,高氯血症代谢酸中毒,过量注射生理盐水等。
( 2)血清(浆)氯化物减低:
临床上低氯血症较为多见。常见原因有氯化钠的异常丢失或摄入减少,如严重呕吐、腹泻,胃液、胰液或胆汁大量丢失,长期限制氯化钠的摄入,艾迪生病,抗利尿素分泌增多的稀释性低钠、低氯血症。
2.尿氯化物异常
尿中氯离子浓度在一天中变化比较大,故尿的测定需要留取24小时的全部尿液。尿氯离子的升高和降低基本同尿钠离子一致。
( 1)尿氯离子升高见于:
严重的肾盂肾炎、急性肾小管坏死、肾病综合征、肾衰竭、碱中毒,以及摄入咖啡因、利尿剂等药物。
( 2)尿氯离子降低见于:
进食含钠过少的食物、库欣综合征、原发性醛固酮增多症、慢性肾衰竭晚期、腹泻、吸收不良,以及摄入皮质类固醇、肾上腺素等药物。
3.脑脊液氯化物异常 ( 1)脑脊液中氯化物明显降低:
见于低氯血症,如呕吐、脱水、肺炎球菌肺炎、细菌性或真菌性脑膜炎。
脑脊液氯化物测定对化脓性脑膜炎和结核性脑膜炎的鉴别有重要意义,后者降低较前者更为显著,且结核性脑膜炎时脑脊液氯化物降低早于糖降低,提示预后不良。另外,化脓性脑膜炎、结核性脑膜炎等后期,氯化物降低常与脑膜渗透压改变和脑脊液中蛋白质增加有关。
( 2)脑脊液中氯化物增加:
尿毒症和慢性肾炎最常见,病毒性脑炎、脑脓肿、神经梅毒时含量可正常或稍高。