第五节　血清总钙测定

钙是人体中含量最多的阳离子。血清总钙由三部分组成:游离钙或离子钙，占钙总量的50%;蛋白结合钙，大部分与血浆白蛋白结合，只有少部分与血浆球蛋白结合，占钙总量的45%;复合结合钙，此部分钙与阴离子(尤其是磷酸盐)结合，占钙总量的5%。
在常规测定条件下，测量总钙比测量离子钙更简单易行，但其缺点是总钙的血浆浓度明显地受到总蛋白的影响，尤其是受到白蛋白的影响。白蛋白下降10g/L将导致总钙减少大约0.25mmol/L ( 1mg/dl)。
血清总钙( total calcium，total Ca)的测定方法有比色法(最常用的是邻甲酚酞络合酮法、甲基麝香草酚蓝法、偶氮砷Ⅲ法)、火焰光度法、原子吸收分光光度法、滴定法(氧化还原滴定法、络合滴定法)、放射性核素稀释质谱法等。IFCC推荐钙测定的决定性方法为放射性核素稀释质谱法，参考方法为原子吸收分光光度法。WHO和我国卫生部临床检验中心( 1997年)推荐的常规方法为邻甲酚酞络合酮法( OCPC)。
世界卫生组织推荐中等规模实验室使用OCPC法，该法灵敏度较高，方法简便、快速、稳定，同时适用于手工和自动化分析仪。但反应体系受pH影响较大，且存在污染问题。精密度:批内CV为1.08%～2.13%，批间CV为3.05%～4.12%，线性范围为1.25～3.75mmol/L，回收率为98%～102%。
偶氮砷Ⅲ比色法是近年来发展起来的血清总钙的比色测定法，具有试剂稳定、本底吸光度低、无强碱、适于手工操作和自动化分析仪等优点。但仍因目前全自动生化分析仪的设计原理存在试剂间化学污染的缺陷，且污染发生具有偶然性，导致结果判断存在一定困难。
离子选择电极法避免了污染的影响，同时可以检测总钙和血清离子钙。

一、检测方法

(一)邻甲酚酞络合酮比色法 【原理】

邻甲酚酞络合酮是金属络合指示剂，同时也是酸碱指示剂，在碱性溶液中与钙及镁螯合，生成紫红色螯合物。作钙测定时，在试剂中加入8-羟基喹啉以消除标本中镁离子的干扰。

1.手工检测 【试剂】 ( 1)邻甲酚酞络合酮显色剂:

称取8-羟基喹啉500mg，置烧杯中，加浓盐酸5ml，使其溶解并转入500ml容量瓶中，再加入邻甲酚酞络合酮25mg，待完全溶解后，加1ml Triton X-100，混匀，然后加去离子水至刻度，置聚乙烯瓶内保存。

( 2) 1mol/L AMP碱性缓冲液:

于1L容量瓶中置去离子水500ml，加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇( 2-amino-2-methyL-l-propanol，AMP) 89.14g，待完全溶解后加水至刻度，置聚乙烯瓶中室温保存。

( 3)显色应用液:

应用时，根据当日标本的多少将上述两液等量混合。

( 4)钙标准液　( 2.5mmol/L) :

精确称取经110℃干燥12小时的碳酸钙250mg，置于1L容量瓶内，加稀盐酸( 1份浓盐酸加9份去离子水) 7ml溶解后，加去离子水约900ml，然后用500g/L醋酸铵溶液调节至pH 7.0，最后加去离子水至刻度，混匀。

【操作】

取试管3支，注明测定管、标准管和空白管。向测定管中加入血清0.05ml，标准管中加入钙标准液0.05ml，空白管中加去离子水0.05ml。向上述各管加显色应用液4ml，混匀，放5分钟后，分光光度计波长575nm，比色杯光径10mm，用空白管调零，读取测定管和标准管的吸光度。
如遇标本混浊、黄疸或溶血，需作校正试验。比色测定后，向空白管及测定管中各加入5g/L EGTA［乙二醇双( 2-氨基乙基醚)四乙酸］溶液0.05ml，再测吸光度，先后两次测定的吸光度差，即为校正吸光度。

【结果计算】

2.自动化分析仪检测 【试剂】

R1: 2-氨基-2-甲基-1-丙醇1.0mmol/L。
R2:邻甲酚酞络合酮( OCPC) 0.22mmol/L; 8-羟基喹啉2.50mmol/L。

【操作】

血清样品与试剂Ⅰ混合，温育，加入试剂Ⅱ，温育一定时间后监测特定波长下的吸光度。主要反应条件如下:
方　法: OCPC法/终点法
样本/试剂: 7μl/360μl/180μl
主波长: 570nm　反应温度: 37℃
副波长: 546nm　反应时间: 10分钟
不同实验室具体反应条件会因所使用的仪器和试剂而异，在保证方法可靠的前提下，应按仪器和试剂说明书设定测定条件，进行定标品、质控样品和血清样品分析。

【结果计算】

测定管吸光度为A 1，空白管吸光度为A 2。
ΔA = A 1－A 2。

全自动生化分析仪系统内部进行所有数据计算，并产生最终报告结果。

【参考区间】

成人血清钙浓度: 2.11～2.52mmol/L(数据引自WS/T 404.6《临床常用生化检验项目参考区间》)。
儿童: 2.25～2.67mmol/L ( 8.98～10.78mg/dl)。
单位换算系数:血清钙( mg/dl) =血清钙( mmol/L)×4。

3.注意事项 ( 1)血液标本采集要求及稳定性:

采样时静脉压迫用力需轻，因为静脉压迫一段时间可能导致钙总量上升10%及因酸中毒而导致的钙离子的升高;可用血清或肝素抗凝血浆标本，不能用钙螯合剂( EDTA-Na 2)及草酸盐作抗凝剂的标本。标本室温放置30～45分钟后离心分离血浆或血清。从接收标本到上机检测的最长时间限制是4小时，15～30℃的环境下不应超过8小时。如无法在4小时内完成，血清或血浆应保存在2～8℃。如无法在48小时内完成，应保存在－20℃。

( 2)尿液标本要求:

采集尿液样本时，整个收集的过程应该在2小时内完成。若是检测24小时尿液的样本，保存样本的容器应该放置在冰箱或是在保存的过程中持续冰浴。假如需要防腐剂，应当在尿液收集前事先加入容器中。

( 3) pH要求:

此反应对pH敏感。中性、酸性，邻甲酚酞络合酮无色;碱性，呈紫红色。pH 10.5～12之间此反应敏感性好，所以反应选用pH 11.0为宜。

( 4)去除Mg2 +干扰:

8-羟基喹啉络合Mg 2 +。去除Mg 2 +干扰，Mg 2 +也可与邻甲酚酞络合酮反应。

( 5)玻璃器皿要求:

邻甲酚酞络合酮试剂灵敏度很高，所用的试管和器皿如有微量的钙污染亦会引起测定误差，因此最好用一次性塑料试管，所有试剂应在聚乙烯瓶内保存。如果条件不允许而使用玻璃试管和器皿时，一定要先经稀盐酸泡洗，再用去离子水冲净后方可使用。

( 6)温度要求:

反应对温度很敏感，应严格控制反应温度。

( 7)二点定标:

若试剂吸光度较高时，则标准曲线不通过零点，产生负截距。遇此情况，可在试剂中加入适量的EDTA-Na 2(注意:试剂应呈淡紫色，不可无色)或用1.25mmol/L、2.5mmol/L标准液作二点定标。

(二)甲基麝香草酚蓝比色法 【原理】

血清中钙离子在碱性溶液中与甲基麝香草酚蓝结合，生成蓝色的络合物。加入适量的8-羟基喹啉，可消除镁离子对测定的干扰，与同样处理的钙标准液进行比较，以求得血清总钙的含量。

1.手工检测 【试剂】 ( 1)甲基麝香草酚蓝贮存液:

称取8-羟基喹啉4.0g溶于50ml去离子水中，再加浓硫酸5ml，搅拌促使其溶解，移入1L容量瓶中，加甲基麝香草酚蓝0.2g，聚乙烯吡咯烷酮( PVP) 6.0g，最后用蒸馏水稀释至刻度，贮存于棕色瓶中，置冰箱保存。

( 2)碱性溶液:

取二乙胺溶液35ml于1L容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，在室温保存。

( 3)显色应用液:

临用前，根据标本量取1液1份与2液3份混合即可。

( 4)钙标准液:

精确称取经110℃干燥12小时的碳酸钙250mg。置于1L容量瓶内，加稀盐酸( 1份浓盐酸加9份去离子水) 7ml溶解后，加去离子水约900ml，然后用500g/L醋酸铵溶液调至pH 7.0，最后加去离子水至刻度，混匀。

【操作】

按表2-3-4进行操作。
表2-3-4　钙甲基麝香草酚蓝比色法测定操作步骤
将以上各管混匀，10分钟后，分光光度计波长610nm，比色杯光径10mm，空白管调零，读取各管吸光度。

【结果计算】

2.自动化分析仪检测 【试剂】

( 1) R1碱性缓冲液:乙醇胺　202g/L
( 2) R2显色试剂:甲基麝香草酚蓝络合剂
0.09mmol/L
聚乙烯吡咯烷酮　3.5g/L
8-羟基喹啉　13.7mmol/L

【操作】

血清样品与试剂R1混合，温育，加入试剂R2，温育一定时间后监测特定波长下的吸光度。主要反应条件如下:
方　法:甲基麝香草酚蓝比色法/终点法
样本/试剂: 7μl/360μl/180μl
主波长: 610nm　反应温度: 37℃
副波长: 700nm　反应时间: 10分钟
不同实验室具体反应条件会因所使用的仪器和试剂而异，在保证方法可靠的前提下，应按仪器和试剂说明书设定测定条件，进行定标品、质控样品和血清样品分析。

【结果计算】

测定管吸光度为A 1，空白管吸光度为A 2。
ΔA = A 1－A 2。

全自动生化分析仪系统内部进行所有数据计算，并产生最终报告结果。

【参考区间】

成人血清钙浓度: 2.08～2.60mmol/L ( 8.3～10.4mg/dl)。
儿童: 2.2～2.80mmol/L ( 8.9～11.2mg/dl)。
单位换算系数:血清钙( mg/dl) =血清钙( mmol/L)×4。

3.注意事项 ( 1)血液标本类型及稳定性:

本法可用肝素抗凝血，不能用钙螯合剂和草酸盐抗凝。标本室温放置30～45分钟后离心分离血浆或血清。从接收标本到上机检测的最长时间限制是4小时，15～30℃的环境下不应超过8小时。如无法在4小时内完成，血清或血浆应保存在2～8℃。如无法在48小时内完成，应保存在－20℃，但不可反复冻融。

( 2)尿液标本要求:

采集尿液样本时，整个收集的过程应该在2小时内完成。若是检测24小时尿液的样本，保存样本的容器应该放置在冰箱或是在保存的过程中持续冰浴。假如需要防腐剂，应当在尿液收集前事先加入容器中。

( 3)干扰因素:

胆红素、蛋白质、无机磷对测定结果无影响。脂血有影响，需用血清(样品)做空白消除其浊度影响。

(三)偶氮砷Ⅲ比色法 【原理】

碱性条件下在含有8-羧基喹啉-5-磺酸的反应体系中，镁离子被掩蔽，偶氮砷Ⅲ与钙离子反应形成紫色络合物，在波长为580nm处有一吸收峰，反应液580nm处的吸光度与钙离子浓度在一定范围内成正比。

1.手工检测 【试剂】 ( 1)偶氮砷Ⅲ试剂:

称取偶氮砷Ⅲ( MW = 776.4) 116.5mg，溶于1000ml pH 7.0 50mmol/L磷酸盐缓冲液中。

( 2)钙标准液　( 2.5mmol/L) :

精确称取经110℃干燥12小时的碳酸钙250mg。置于1L容量瓶内，加稀盐酸( 1份浓盐酸加9份去离子水) 7ml溶解后，加去离子水约900ml，然后用500g/L醋酸铵溶液调至pH 7.0，最后加去离子水至刻度，混匀。

【操作】

测定管( U)、标准管( S)、空白管( B)依次加入待检血清或10倍稀释的尿液，2.5mmol/L标准液和水20μl，各加试剂3ml，混匀，室温放置5分钟。空白管调零，分光光度计600nm、比色杯光径1cm，空白管调零，读取各管吸光度。

【结果计算】

2.自动化分析仪检测 【试剂】

R1: Tris-HCl缓冲液　0.2mmol/L
R2: 8-羟基喹啉　4.0mmol/L
偶氮砷Ⅲ　80.0mmol/L

【操作】

血清样品与试剂Ⅰ混合，温育，加入试剂Ⅱ，温育一定时间后监测特定波长下的吸光度。主要反应条件如下:
方　法:偶氮砷Ⅲ法/终点法
样本/试剂: 2μl/100μl/100μl
主波长: 600nm　反应温度: 37℃
副波长:无　　反应时间: 10分钟
不同实验室具体反应条件会因所使用的仪器和试剂而异，在保证方法可靠的前提下，应按仪器和试剂说明书设定测定条件，进行定标品、质控样品和血清样品分析。

【结果计算】

测定管吸光度为A 1，空白管吸光度为A 2。
ΔA = A 1－A 2。

全自动生化分析仪系统内部进行所有数据计算，并产生最终报告结果

【参考区间】

成人血清: 2.2～2.7mmol/L。
成人尿液: 25～38mmol/24h。
儿童血清: 2.5～3.0mmol/L。
以上参考区间引自试剂说明书。
单位换算系数:血清钙( mg/dl) =血清钙( mmol/L)×4。

3.注意事项 ( 1)安全性:

砷Ⅲ是有毒物质，一旦污染皮肤需要用大量水冲洗。

( 2)干扰因素:

溶血和胆红素无干扰，Hb 20g/L，Bil 20mg/L可无影响，适合新生儿溶血症的标本。脂血可产生正干扰，所以需要加血清空白。

( 3)标本类型:

可用肝素抗凝，螯合剂、EDTA、草酸盐不能用于此法。

( 4)尿液标本要求:

浑浊尿应当离心后检测。

( 5)治疗药物影响:

治疗中使用维生素D、葡萄糖酸钙、双氢氯丙嗪、雌激素、黄体酮、己烯雌酚、睾酮等药物可使血清总钙结果偏高;使用苯妥英钠、苯巴比妥、利尿剂、硫酸钠等药物可使测定血清总钙结果偏低。使用呋塞米或长期服用肾上腺皮质激素的患者，尿钙含量可增高。

二、临床意义

1.血清总钙异常 ( 1)血清总钙增高:

见于甲状旁腺功能亢进、多发性骨髓瘤、结节病、大量应用维生素D治疗引起肠道过量吸收钙。

( 2)血钙降低:

可引起神经肌肉应激性增强而使手足搐搦，见于:婴儿手足搐搦症、维生素D缺乏症、引起血清清蛋白减少的疾病(恶性肿瘤、严重肝病等)，伴高血磷见于甲状旁腺功能减退(甲状旁腺分泌不足)和慢性肾衰竭，伴血磷正常或偏低见于佝偻病、骨软化症。

2.尿钙异常 ( 1)尿钙增高:

见于甲状旁腺功能亢进、维生素D 3摄入过多、特发性高尿钙症、溶解性骨癌及骨肉瘤骨转移、Paget病、结节病、骨质疏松、肢端肥大、肾小管损伤等。

( 2)尿钙降低:

见于甲状旁腺功能减退、维生素D缺乏症、佝偻病、慢性肾衰软骨病、手足搐搦症、低钙膳食、尿毒症。
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