第二十三节 尿视黄醇结合蛋白测定

视黄醇结合蛋白( retinol-binding protein,RBP)是维生素A的运载蛋白,结构上为疏水小分子结合蛋白家族的成员。RBP在维生素A的储存、代谢、转运到周围靶器官中发挥重要功能。血浆中的RBP大部分与甲状腺结合前白蛋白结合形成复合物,小部分的未结合的RBP (<10%)可自由通过肾小球膜,被近曲小管重吸收进行代谢降解。正是由于肾小管的重吸收作用,正常患者尿液中仅有微量的RBP。因此,一旦尿液中RBP浓度升高,提示近段肾小管损伤或功能受损,有助于肾脏疾病的辅助诊断。
目前常用的检测尿RBP的方法有免疫透射比浊法和酶联免疫吸附法。

一、检测方法

(一)透射比浊法 【原理】

RBP免疫透射比浊法测定的原理为利用抗原( RBP)和特异性抗体(羊抗RBP抗血清)相结合,形成不溶性免疫复合物,使反应液产生混浊,其浊度高低即透光度减少、吸光度增加反映尿液中RBP的含量,由定标品所做的剂量反应曲线算出。

【试剂】

尿视黄醇结合蛋白透射比浊法试剂盒基本组分:

1.试剂1 ( R1)

pH 7.2~7.6磷酸盐缓冲液
聚乙二醇6000
EDTA-Na 2

2.试剂2 ( R2)

羊抗人RBP抗血清
磷酸盐缓冲液
目前各商品试剂与上述试剂相似,但试剂1和2组成及各成分浓度存在一定差异。

【操作】

透射比浊法属于两点终点法,测定过程为尿液样本与R1混合,37℃孵育5分钟,读测第1点吸光度( A 1) ;加入R2,37℃孵育5分钟,读测第2点吸光度( A 2) ;最后得到样本的吸光度A = A 2-A 1。主要反应条件如下:
样品-试剂最终比例 1∶15
反应温度 37.0℃
温育时间 5分钟
波长  主波长405nm,副波长700nm
反应时间 5分钟
不同实验室具体反应条件会因所使用的仪器和试剂而异,在保证方法可靠的前提下,应按仪器和试剂说明书设定测定条件,进行定标品、质控样品和尿液样品分析。

【结果计算】

仪器通过多点定标的方式建立参考曲线。

【参考区间】

成人尿RBP:<0.7mg/L (此参考区间试剂说明书)。

【注意事项】

尿液RBP检测的标本可以是24小时尿液,也可以是随机尿。一般而言,收集24小时尿液进行RBP检测是比较常用和标准的做法。而随机尿RBP需要用尿肌酐进行校正。样品的浊度以及样本中含有的颗粒(细胞、结晶)会影响检测结果,所有尿液样本在检测前需在室温环境下进行离心。

(二)酶联免疫吸附法 【原理】

以抗RBP单克隆抗体(单抗)包被于聚苯乙烯反应板微孔中。待测样本(或RBP标准品)中的RBP可与之结合,再依次加入酶标抗体经过一定时间的孵育,在固相形成“抗RBP抗体-RBP-酶标抗体复合物”,加酶底物和显色剂显色,显色强度与样本中RBP中的浓度成一定比例。

【试剂】

购买专用商品试剂盒。

【操作】

按试剂盒说明书操作,举例如下:
1.自冷藏处取出试剂盒,恢复至室温( 18~25℃)。配制试剂与RBP定标品;稀释待测血清。
2.加入待测尿液样本、不同浓度RBP定标品、分析液各50μl于相应的微孔中。其中加分析液的微孔作为最大结合孔( B0)。另设2孔作为非特异结合孔( NSB),加入75μl分析液。
3.各孔加入25μl RBP-过氧化物酶结合物。
4.除了NSB孔,各孔加入抗RBP抗体25μl,混匀后箔纸封板,在室温下放置1小时。
5.吸出孔内液体后,每孔注入清洗液300μl洗孔,共4次,甩尽孔内液体,用吸水纸拍干。
6.每孔加入100μl四甲基联苯胺( TMB)溶液,在室温下放置30分钟。
7.加终止液每孔100μl,轻轻混匀,30分钟内于酶标仪450nm波长测吸光度。

【结果计算】

以RBP定标品浓度为横坐标,相应吸光度为纵坐标,制备标准曲线。待测样本中RBP浓度可根据所测吸光度从标准曲线得出。

【参考区间】

成人尿RBP:<0.7mg/L (此参考区间引自试剂说明书)。

【注意事项】

过期试剂不得使用;不同厂家、不同批号试剂不可混用。

二、临床意义

尿RBP升高提示近端肾小管损伤和功能异常,有助于肾脏疾病的诊断和监测。
引起尿RBP升高的主要肾脏疾病有:①肾小管间质性肾炎;②重金属或肾毒性药物引起的小管中毒;③肾小球肾病和肾血管疾病经常合并小管损伤,也可能引起尿中RBP水平升高。